Peter Parker (Tobey Maguire) wird von seinen Mitschülern gehänselt und von Mädchen einfach übersehen. Seit seiner Kindheit ist der bei Onkel Ben und Tante May (Cliff Robertson, Rosemary Harris) im New Yorker Stadtteil Queens aufgewachsene Waisenknabe in die Nachbarstochter Mary Jane Watson (Kirsten Dunst) verliebt – aber die bevorzugt einen sportlichen Mitschüler, der in der Hackordnung ganz oben steht.

Bei einem Schulausflug in ein Forschungsinstitut, das genmanipulierte Spinnen züchtet, um die außergewöhnlichen Fähigkeiten verschiedener Spinnenarten zu kombinieren, wird Peter von einem der Versuchstiere in die Hand gebissen. Am nächsten Morgen stellt er verwundert fest, dass er plötzlich ohne Brille schärfer sieht als mit. Als Mary Jane in der Schulkantine neben Peter ausrutscht und ihr Tablett durch die Luft fliegt, fängt Peter blitzschnell nicht nur das Mädchen, sondern auch Tablett, Glas und Teller auf. Bei einer Rauferei mit Mary Janes Freund weicht er den Angriffen seines Gegners geschickt aus und schleudert ihn dann mit einem einzigen Schlag quer durch den Saal. Peter entdeckt nicht nur ungeahnte Kräfte und eine übermenschliche Reaktionsgeschwindigkeit, sondern auch, wie er aus den Handgelenken lange, klebrige und reißfeste Spinnfäden schießen kann.

Um sich ein Auto leisten zu können, meldet er sich in einem improvisierten Kostüm mit einer aufgemalten Spinne für einen Wrestling-Kampf gegen „Bone Saw McGraw“ (Randy Poffo). Aber statt der versprochenen 3000 Dollar Siegerprämie erhält „Spider-Man“ bloß einen 100-Dollar-Schein. Deshalb unternimmt er auch nichts, als im nächsten Augenblick ein Gauner den Wettkampfveranstalter überfällt und mit dem geraubten Geld flieht. Auf der Straße bemerkt er eine Menschenansammlung. Sein Onkel liegt am Boden. Der Räuber hat ihn erschossen. Wenn Peter bei dem Überfall eingegriffen hätte, wäre es nicht geschehen!

Er sorgt dafür, dass die Polizei den Mörder seines Onkels zu fassen bekommt. An seinen Spinnfäden schwingt er sich in einem neuen hautengen Outfit von Wolkenkratzer zu Wolkenkratzer, um Menschen beizustehen, die gerade überfallen werden. Aus einer brennenden Wohnung rettet er einen Säugling. Nie wird er vergessen, was sein Onkel zu ihm sagte: „Große Macht bedeutet auch große Verantwortung.“

Der skrupellose Chefredakteur des „Daily Bugle“, J. Jonah Jameson (J. K. Simmons) schlachtet die Meldungen über den neuen Helden aus, aber niemand ahnt, wer sich hinter der Maske verbirgt – auch Peters einziger Schulfreund Harry Osborn (James Franco) nicht.

Harry wird von seinem Vater als Versager verachtet. Norman Osborn (Willem Dafoe) ist ein genialer Wissenschaftler und Unternehmer, der mit allen Mitteln erreichen will, dass die Regierung einen zukunftsweisenden Auftrag an seine Firma vergibt –

obwohl ein Mitarbeiter davor warnt, weil die Forschungsarbeiten noch nicht abgeschlossen sind. Norman Osborn probiert die Erfindung im Selbstversuch aus, entwickelt dabei tausendfache Kräfte und erwürgt den Mahner in seinen Reihen. Am nächsten Morgen erwacht er wieder in seiner normalen Gestalt. Als ihn der Vorstand loswerden möchte, um die Firma mit Gewinn an ein Konkurrenzunternehmen verkaufen zu können, schwört Norman Osborn Rache. Im Spiegel erkennt er das Böse in sich. Als grüner Kobold verkleidet jagt er auf einem selbst entwickelten Miniflugzeug stehend durch die Luft und tötet seine Widersacher. Wie Peter Parker auch, legt Norman Osborn seine Verkleidung nur stundenweise an, aber im Gegensatz zu Spider-Man wird er dabei zum Bösewicht. Zwischen den beiden muss es zum Showdown kommen.

Wenn Sie noch nicht erfahren möchten, wie es weitergeht,
überspringen Sie bitte vorerst den Rest der Inhaltsangabe.

Norman Osborn findet heraus, wer das Spinnenkostüm trägt, und als sein Sohn ihm erzählt, dass Peter Parker seit seiner Kindheit Mary Jane Watson liebt, bringt er sie in seine Gewalt. Auf einer hohen Brücke erwartet er Spider-Man und stellt ihn vor die Alternative: Entweder lässt er Mary Jane fallen, die in seinem linken Arm über dem Abgrund zappelt, oder er öffnet seine rechte Hand, mit der er das durchtrennte Tragseil einer Seilbahnkabine mit einem Dutzend Schülern hält. In einem übermenschlichen Kraftakt gelingt es Spider-Man, sowohl Mary Jane als auch die Schüler zu retten. Im letzten Augenblick weicht er einem heimtückischen Angriff seines Gegners mit einem ferngesteuerten Miniflugzeug aus, das daraufhin den grünen Kobold trifft und tötet.

Bei der Beerdigung seines Vaters schwört Harry Osborn, sich an Spider-Man zu rächen – ohne zu ahnen, dass es sich dabei um seinen Freund handelt.

Mary Jane küsst ihren Lebensretter und gesteht ihm ihre Liebe. Peter Parker aber weiß um seine Verantwortung – und zieht es vor, allein zu bleiben.